樟芝对平滑肌细胞的迁移及老鼠颈动脉新生内膜形成的抑制作用
钟幸君医师南台科技大学
摘要
动脉粥状硬化(Atherosclerosis)是心血管疾病中主要的疾病，在动脉粥状病变与血管再窄化发展病程中，血管平滑肌细胞从中膜层迁移至新生血管内膜是血管形成病变的重要的因素。在血管受伤病变过程中，平滑肌细胞会由收缩态转变为合成态，并由血管中层往内膜层增生和迁移，导致血管内膜增厚。樟芝(Antrodiacamphorata，AC)是一种中国传统常见的药品，它具有抑制肿瘤细胞增生及迁移的作用。此论文欲研究樟芝对大鼠动脉平滑肌细胞(Rataorticsmoothmusclecell；RASMC：A7r5)的增生及迁移是否也具有抑制效果；并且评估其对老鼠颈动脉受伤后之新生内膜生成的影响。MTT和BrdU增生实验主要是研究樟芝对平滑肌细胞增生作用的影响，由MTT和BrdU实验结果皆显示樟芝可抑制血小板衍生生长因子(PDGF)所引起平滑肌细胞的增生作用。在Transwell迁移实验中，大鼠动脉平滑肌细胞(RASMC)先用樟芝萃取液或食盐水处理后，然后血小板衍生生长因子(PDGF)加在Transwell的下层刺激细胞迁移，计算由上层迁移到下层的细胞数目。在woundscratchassay中，大鼠动脉平滑肌细胞(RASMC)用樟芝萃取液或食盐水预先处理，使用pipettetips刮除细胞；然后用血小板衍生生长因子(PDGF)刺激并培养24小时。
此2个实验结果皆显示樟芝可显著抑制血小板衍生生长因子(PDGF)所引起的平滑肌细胞迁移作用。动物实验方面，将C57BL/6老鼠的左边颈动脉在靠近分支处结扎手术，术后的老鼠用水及樟芝萃取液连续灌食4星期，新生内膜生成的严重性则用新生内膜/中层(neointima/media，N/M)比例来表示。在4星期后，以樟芝萃取液治疗，经颈动脉结扎的老鼠其新生内膜生成较少(N/Mratio,水控制组,n=13vs樟芝mg/kg,n=12vs樟芝1mg/kg,n=12；1.33±0.87vs0.83±0.45vs0.63±0.32，P0.05)。
实验结果显示樟芝对于血小板衍生生长因子(PDGF)引起平滑肌细胞的增生和迁移作用是个有效的抑制剂，另外以樟芝治疗也可降低老鼠颈动脉结扎手术后的新生内膜的生成。
結果讨論
动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是冠狀动脉疾病主要致病机制，而在目前臨床上治療冠狀动脉疾病的主要方式是气球血管扩张术，然而手术后约有35~40%病人会因为血管新生内膜(neointima)增厚而发生血管再狭窄(restenosis)情形。因此，有许多研究利用动物模式针对血管再狭窄的相关机制进行探讨。而由过去的研究中得知，血管受伤过程中，平滑肌细胞型态会由收缩态变成合成态，并且由血管中层往内膜层移行及增生(Schwartzetal.,)。因此利用颈动脉结扎所导致的血管内膜增厚，针对血管平滑肌细胞、血小板衍生生长因子(PDGF)及樟芝萃取液的相关性进行探讨。
此研究计划的目的在了解樟芝(Antrodiacamphorata；AC)萃取液对血管平滑肌细胞的作用。发现樟芝萃取液可显著抑制血小板衍生生长因子(PDGF)刺激所引起的血管平滑肌细胞(A7r5cell)的增生和迁移。另外樟芝萃取液亦会抑制平滑肌细胞经血小板衍生生长因子(PDGF)刺激后MMP-2表现量。而老鼠颈动脉结扎手术后以樟芝萃取液治療亦可降低新生内膜(neointima)形成的严重性。
在亚洲地区，利用某些真菌類治療疾病已有非常久远的歷史。例如靈芝(Ganodermalucidum)就是一种很受欢迎的菇類，它被发现对于癌症的治療有很显著的效果(Yuenetal.,andSliva,)。樟芝最早被归類于靈芝属(Ganoderma)，然而后來的研究却发现它是种新的担子菌门－樟芝属多孔菌科(Polyporaceae)(Wuetal.,)。近几年來樟芝被广泛地用來治療癌症，同时发现它可降低癌细胞增生，及阻止癌症细胞生长和抑制癌细胞迁移。之前的研究显示樟芝萃取液可以造成细胞周期(Cellcycle)的休止，某些癌细胞株的细胞周期调节蛋白的失调(Pengetal.,)。生物学作用上，癌细胞和动脉受伤后活化的平滑肌细胞在增生和迁移作用上有许多相似特性。樟芝作用于活化的血管平滑肌细胞于从未被研究过。因为构成血管壁细胞间质主要为胶原蛋白第一型（collagentypeI）和fibronectin，且胶原蛋白第一型会在动脉粥狀硬化斑(plaques)中大量的表现（Maetal.,）。因此在细胞迁移实验中便以胶原蛋白第一型浸润间隔膜，以模拟平滑肌细胞在血管中的环境。而平滑肌细胞的迁移是借着调控细胞表面的黏着分子（adhesionmolecules）及其与细胞外基质间的相互作用（interatcion）而达成。此研究发现樟芝萃取液可有效降低血小板衍生生长因子(PDGF)刺激平滑肌细胞(A7r5)引起的增生和迁移作用。此一效用不是由樟芝的药物毒性造成，因为平滑肌细胞存活性试验中显示在以樟芝萃取液浓度10-μg/ml和食盐水加入平滑肌细胞培养时造成的细胞死亡并没有显著的差異。
樟芝对于平滑肌细胞增生和迁移抑制作用，其机制目前尚不清楚。经过血小板衍生生长因子(PDGF)和其他的生长因子刺激平滑肌细胞(A7r5)，会引发增生作用并促使型态由收缩态转变为合成态。平滑肌细胞(A7r5)会从血管中层(media)迁移至内膜层(intima)并分泌细胞内的基质蛋白导致新生内膜的形成和血管的窄化现象。在此过程中，平滑肌细胞(A7r5)也会表现并释放许多的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases；MMPs)來分解到胞内基质蛋白和促进平滑肌细胞(A7r5)的迁移(Bendecketal.,；Zempoetal.,)。另有研究使用蛋白质体试验主要是用來搜寻肺癌细胞以樟芝治療后其蛋白质表现的不同(Wuetal.,)，他们发现樟芝会减少与细胞成长和增生作用的蛋白质，例如明胶(gelatin)，哺乳动物转译作用启始基因5A，GDP分離基因α和Calpain调节次单位，Calpain也会调节MMPs的表现量(Poppetal.,)。MMPs在细胞外的基质中扮演一个重要的角色主要会促进血管平滑肌细胞增生和迁移作用。在血管粥样硬化(atherosclerosis)和新生内膜生成过程中，许多细胞激素和生长因子会刺激血管平滑肌细胞(A7r5)表现MMPs。在本研究用zymography电泳分析显示樟芝萃取液对抑制MMP-2表现有剂量的相关性作用。先前的研究显示樟芝对膀胱癌和肺癌细胞同样可以降低其MMPs的表现量(Pengetal.,；Wuetal.,)。所以降低MMPs表现量在樟芝对于平滑肌细胞(A7r5)的迁移作用而言可能是个重要的机制。
进一步的细胞实验证明，灌食樟芝萃取液在颈动脉结扎手术的老鼠会降低其新生内膜(neointima)形成的严重性。动物实验时，选择樟芝的口服剂量是依据过去已发表过的研究，此剂量用于减少老鼠肝脏的发炎，结果显示这些剂量并不会产生显著的毒性(Hsiaoetal.,)。樟芝对新生内膜(neointima)的减少，主要可能來自减少平滑肌细胞的增生及迁移，这些都提供了樟芝的保护作用。但其他关于樟芝生物学方面效用可能也有贡献。例如之前的研究也明白地显示樟芝可以对化学性引起的肝脏伤害(Hsiaoetal.,)和脂肪过氧化反应并产生保护效用(Yangetal.,)。另外也有研究发现由樟芝分離出來的zhankuicacid具有抗发炎活性能力(Shenetal.,)。
本研究最主要限制在于此天然产物成分相当复杂。樟芝于生物学方面显示引起效用的成分主要是三萜化合物(triterpeneacids)、多醣(polysaccharides)、固醇類(steroidacids)和超氧歧化酵素(SOD)等。虽然此天然产物成分复杂但也是其优势之ㄧ，当用在药物治療时因为不同的化合物成分反而使其产生协同作用而加强樟芝的效果，并且降低产物的毒性。然而仍要进一步的研究确认樟芝的哪些活性成分，会对血管平滑肌细胞(A7r5)产生抑制效果，并研究因PDGF刺激后抑制平滑肌细胞(A7r5)增生及迁移作用可能的相关机制。
结論此研究是首先提出关于樟芝对血管的保护作用，不論是在细胞或动物实验，都证实樟芝萃取液对心血管疾病具有潜在的治療效果。
1.如果您喜欢